摘要 為了研究多壁碳納米管(MWCNTs)聯(lián)合納秒脈沖電場(chǎng)(nsPEF)影響離體細(xì)胞活性的劑量效應(yīng)，采用 CCK-8 檢測(cè)法對(duì)比分析皮膚癌 A375 細(xì)胞活性隨場(chǎng)強(qiáng) E、脈寬 τ、脈沖個(gè)數(shù) N 等單因素的變化規(guī)律。研究表明，細(xì)胞活性隨場(chǎng)強(qiáng)和脈寬的變化具有閾值效應(yīng)(S 型變化)，而隨脈沖個(gè)數(shù)的變化無(wú)明顯的閾值效應(yīng)(指數(shù)型變化)。細(xì)胞活性隨脈沖注入能量 E(τN) 0.5 的增加呈現(xiàn) S 型下降。基于 logistic 模型利用一元非線性回歸分析方法分別擬合得到細(xì)胞活性與三個(gè)脈沖參數(shù)間的函數(shù)關(guān)系。同時(shí)，建立細(xì)胞活性與多因素之間的歸一化關(guān)系。結(jié)果表明，MWCNTs 的加入不影響細(xì)胞活性與脈沖參數(shù)間的變化規(guī)律，但是明顯降低了 nsPEF 殺傷腫瘤細(xì)胞所需要的幅值，從而可以有效提高 nsPEF 在腫瘤治療中的電氣安全性。

　　關(guān)鍵詞：多壁碳納米管 納秒脈沖電場(chǎng) 細(xì)胞活性 logistic 模型 歸一化關(guān)系

　　0 引言

　　納秒脈沖電場(chǎng)(nanosecond pulsed electric field， nsPEF)不需要毒性化療藥物的參與就能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡而使腫瘤組織縮小甚至消失，避免了炎癥、潰瘍與藥物的副作用[1,2]，對(duì)于腫瘤治療具有特別重要的意義。然而，nsPEF 必須采用高場(chǎng)強(qiáng)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要借助電極將幅值非常高的脈沖電場(chǎng)引入到腫瘤組織，而過(guò)高的場(chǎng)強(qiáng)容易引起靶向組織的沿面放電[3,4]，這也會(huì)對(duì)治療過(guò)程的順利進(jìn)行、治療設(shè)備的可靠性產(chǎn)生影響。近年來(lái)，碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)優(yōu)異的電學(xué)特性在生物電效應(yīng)中的應(yīng)用潛力逐漸引起人們的關(guān)注。CNTs 是一種具有特殊結(jié)構(gòu)(徑向尺寸為納米級(jí)，軸向尺寸為微米級(jí))的一維量子材料，并且由于碳納米管的結(jié)構(gòu)與石墨的片層結(jié)構(gòu)相同，所以具有高電導(dǎo)率[5]。具備大長(zhǎng)徑比以及優(yōu)良電導(dǎo)率的 CNTs 可以增強(qiáng)局部場(chǎng)強(qiáng)[6]，國(guó)外一些學(xué)者已經(jīng)將 CNTs 的這一特性應(yīng)用到脈沖電場(chǎng)治療腫瘤的領(lǐng)域中。根據(jù)卷曲層數(shù)的差異，CNTs 可以分為單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes， SWCNTs)和多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs)[7]。由于 MWCNTs 的毒性低于 SWCNTs[8]，所以 MWCNTs 在生物電磁中的應(yīng)用更為廣泛。 Stacey 等將 MWCNTs 引入到 nsPEF(50 kV/cm， 300 ns，8 個(gè)脈沖)殺傷胰腺癌細(xì)胞系 PANC1 的實(shí)驗(yàn) 中 ， 利 用 臺(tái) 盼 藍(lán) 檢 測(cè) 細(xì) 胞 存 活 率 [9]。 與 不 加 MWCNTs 的實(shí)驗(yàn)相比，MWCNTs 的引入可以使細(xì)胞存活率降低 2.3 倍，證明 MWCNTs 獨(dú)特的電子特性與脈沖電場(chǎng)在殺傷腫瘤細(xì)胞中的協(xié)同作用。Raffa 等在脈沖電場(chǎng)(45-55 V/cm，40 ms，1 Hz，500 個(gè)脈沖)處理 HN9 及 CRFK 細(xì)胞的過(guò)程中將 MWCNTs (5-10 μg/ml)加入到細(xì)胞懸浮液，以此促進(jìn)細(xì)胞的透化率，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)藥物大分子的攝取，利用臺(tái)盼藍(lán)染料代替藥物大分子檢測(cè)細(xì)胞的通透性[10]。實(shí)驗(yàn)證明 MWCNTs 的引入可以將細(xì)胞通透性由 4% 提高到 80%，并在該實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上提出 MWCNTs 在脈沖電場(chǎng)作用下的介電響應(yīng)可能是導(dǎo)致電穿孔增強(qiáng)的原因。Wang 等在 MWCNTs 的存在下將脈沖電場(chǎng)(50 V/cm，40 ms，5 Hz，500 個(gè)脈沖)作用于乳腺癌細(xì)胞[11]。利用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)到細(xì)胞膜即時(shí)透化率增加至 38.62%，是不含 MWCNTs 實(shí)驗(yàn)的 2.77 倍。此外，還觀察到細(xì)胞發(fā)生了不可逆電穿孔，在脈沖處理后 24 小時(shí)僅有 39.23%的細(xì)胞存活，而不存在 MWCNTs 的細(xì)胞存活率為 87.01%。Liu 等利用有限元法基于介電電泳理論仿真研究了單根 MWCNTs 與細(xì)胞膜在脈沖電場(chǎng)處理下的作用過(guò)程[12]。結(jié)果表明，MWCNTs 尖端在電場(chǎng)中引起的介電泳力能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞膜快速的機(jī)械變形，從而增強(qiáng)細(xì)胞電穿孔效應(yīng)。以上研究都從不同角度證明了 MWCNTs 增強(qiáng)脈沖電場(chǎng)殺傷腫瘤細(xì)胞效果的可行性。但是，迄今為止，MWCNTs 增強(qiáng)脈沖電場(chǎng)殺傷癌細(xì)胞效果的相關(guān)研究也只是在單一脈沖因素、特定參數(shù)范圍的基礎(chǔ)上驗(yàn)證 MWCNTs 的引入具有增強(qiáng)脈沖電場(chǎng)生物電效應(yīng)的作用，沒(méi)有更加系統(tǒng)、全面地建立 MWCNTs 聯(lián)合 nsPEF 殺傷腫瘤細(xì)胞的劑量效應(yīng)。為了對(duì)后續(xù)開(kāi)展機(jī)理研究選擇脈沖參數(shù)提供必要的參考依據(jù)，首先必須從宏觀角度研究引入 MWCNTs 后不同脈沖參數(shù)下的 nsPEF 對(duì)離體細(xì)胞的殺傷效果。對(duì)此，本文將在探究 MWCNTs 毒性的基礎(chǔ)上系統(tǒng)地研究有無(wú) MWCNTs 時(shí)細(xì)胞活性隨場(chǎng)強(qiáng)、脈寬、脈沖個(gè)數(shù)等單因素的定性變化規(guī)律和定量函數(shù)關(guān)系，并建立細(xì)胞活性與多因素的歸一化關(guān)系,以期為后續(xù)在腫瘤組織中的進(jìn)一步研究提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人皮膚癌

　　A375 細(xì)胞系(由第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究院捐贈(zèng))置于高糖 DMEM 培養(yǎng)基(血清和抗生素的占比分別為 10%和 1%)中，于 CO2 體積分?jǐn)?shù)為 5%、溫度為 37℃、飽和濕度的環(huán)境中生長(zhǎng)，1-2 天傳代一次。

　　1.2 MWCNTs 毒性的確定

　　MWCNTs 分散液(W/V=20 000 μg/ml)購(gòu)置于中科院成都有機(jī)化學(xué)有限公司，所用 MWCNTs 的外徑和長(zhǎng)度分別為 8-15 nm 和 50 μm 左右，其在透射電子顯微鏡(transmission electron microscope， TEM)下的微觀結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。取不同體積 MWCNTs 分 散 液 于 新 鮮 培 養(yǎng) 基 中 ， 分 別 調(diào) 整 MWCNTs 的最終濃度為 0 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml、400 μg/ml。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 A375 細(xì)胞用 0.25%的胰酶消化后離心 5 分鐘(800 轉(zhuǎn)/分鐘)，棄去上清液，用上述含有不同濃度 MWCNTs 的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106 cells/ml。將上述細(xì)胞懸液于室溫下靜置 1 小時(shí)后用 PBS 離心清洗兩遍，并用不含 MWCNTs 的新鮮培養(yǎng)基重懸(細(xì)胞濃度為 1×105 cells/ml)，取 200 μl 溶液于 96 孔板中，在 CO2 體積分?jǐn)?shù)為 5%、溫度為 37℃、飽和濕度的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng) 8 小時(shí)。利用 CCK-8 試劑盒檢測(cè)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活性，對(duì)照組為 MWCNTs 濃度為 0 μg/ml 的細(xì)胞懸液。

　　1.3 細(xì)胞活性的檢測(cè)使用

　　CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞活力，當(dāng)含有細(xì)胞的 96 孔板在孵箱中培育 8 小時(shí)后，利用移液器緩慢吸掉 96 孔板上清液，用 PBS 清洗兩遍并重新加入 110 μl 培養(yǎng)基與 CCK-8 的混合溶液(培養(yǎng)基與 CCK-8 的比例為 10:1)，繼續(xù)于孵箱中培養(yǎng) 1.5 小時(shí)。在該測(cè)定中，CCK-8 可以被細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物 Formazan。利用酶標(biāo)儀(EPOCH2，Biotek)測(cè)量每組實(shí)驗(yàn)的吸光度，波長(zhǎng)設(shè)定為 450 nm。細(xì)胞活性=(實(shí)驗(yàn)組吸光值-空白組吸光值)/ (對(duì)照組吸光值-空白組吸光值)×100%，其中空白組為不含細(xì)胞的混合培養(yǎng)液。

　　1.4 nsPEF 系統(tǒng)

　　實(shí)驗(yàn)平臺(tái)如圖 2 所示，相關(guān)裝置包括：實(shí)驗(yàn)室自制的納秒脈沖發(fā)生器[13]、現(xiàn)場(chǎng)可編程邏輯門(mén)陣列( Field-Programmable Gate Array ， FPGA) 模 塊(AX301，Alinx)、個(gè)人電腦(PC)、示波器(WavePro 7 Zi–A，Teledyne Lecroy)、高壓探頭(PPE5KV， Teledyne Lecroy)、 皮 爾 森 線 圈 ( 2877， Pearson Electronics)、電擊杯(BTX，容積 450 μl，間距 2 mm)。在 PC 端對(duì) FPGA 模塊編程，通過(guò)控制 FPGA 產(chǎn)生特定脈寬及頻率的信號(hào)以控制納秒脈沖發(fā)生器的輸出，發(fā)生器的輸出直接連接到裝有細(xì)胞懸浮液的電擊杯兩端，同時(shí)利用示波器對(duì)細(xì)胞懸液兩端的電壓以及流經(jīng)懸液的電流信號(hào)進(jìn)行采集。幅值為 1 kV，脈寬為 300 ns 時(shí)，脈沖電壓和電流波形如圖 3 所示。

　　1.5 nsPEF 處理細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方案

　　表 1 為實(shí)驗(yàn)所采用的脈沖參數(shù)水平值，固定脈沖頻率為 1 Hz，MWCNTs 濃度為安全劑量下的最大值，其余參數(shù)(場(chǎng)強(qiáng) E、脈寬 τ、脈沖個(gè)數(shù) N)均為 5 水平。當(dāng)探究細(xì)胞活性隨某一脈沖參數(shù)的影響規(guī)律時(shí)，其余參數(shù)均設(shè)定為中間值，例如研究場(chǎng)強(qiáng)對(duì)細(xì)胞活性的影響規(guī)律，脈寬和脈沖個(gè)數(shù)分別設(shè)定為 300 ns 和 100。對(duì)于每一組實(shí)驗(yàn)方案，分別在加 MWCNTs 以及不加 MWCNTs 的情況下實(shí)施。為了使大部分細(xì)胞在 nsPEF 處理期間承受更均勻的電場(chǎng)，將貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞酶解為細(xì)胞懸液，然后取 70 μl 細(xì)胞懸液于電擊杯中，此時(shí)大部分細(xì)胞將處于場(chǎng)強(qiáng)更加均勻的電擊杯中間區(qū)域，并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的 nsPEF 處理。對(duì)照組設(shè)置為將同等體積不加 MWCNTs 的細(xì)胞懸液加入電擊杯但是不對(duì)其進(jìn)行 nsPEF 處理。脈沖處理后，利用 CCK-8 試劑盒測(cè)量各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活性，相關(guān)操作與 MWCNTs 毒性實(shí)驗(yàn)相同。

　　1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　采用 OriginPro 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均用 x(均值)±s(標(biāo)準(zhǔn)差)表示，利用單因素方差分析評(píng)估實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性差異。P<0.05 為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

　　2 結(jié)果

　　2.1 MWCNTs 毒性

　　為了將 MWCNTs 引入到 nsPEF 殺傷細(xì)胞的研究中，必須保證其對(duì)細(xì)胞具有低毒性，即高的生物相容性。A375 細(xì)胞生長(zhǎng)于含有不同濃度 MWCNTs 的環(huán)境中，通過(guò)測(cè)量 MWCNTs 對(duì)細(xì)胞活性的影響確定合理的 MWCNTs 濃度。圖 4 顯示，當(dāng) MWCNTs 濃度為 300 μg/ml 時(shí)，細(xì)胞活性降低到 92%，并且隨著 MWCNTs 濃度的升高，細(xì)胞活性越低，與對(duì)照 組 相 比 ， 組 間 及 組 內(nèi) 數(shù) 據(jù) 都 具 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 差 異(P<0.05)。相反，當(dāng) MWCNTs 濃度小于或等于 200 μg/ml 時(shí)，細(xì)胞活性幾乎沒(méi)有變化，表明在此濃度范圍內(nèi)，MWCNTs 對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響，與對(duì)照組相比，組間及組內(nèi)數(shù)據(jù)都不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。即后續(xù) nsPEF 處理 A375 細(xì)胞所用 MWCNTs 濃度小于或等于 200 μg/ml 即可。

　　2.2 細(xì)胞活性隨不同脈沖參數(shù)的變化規(guī)律

　　設(shè)定 nsPEF 處理 A375 細(xì)胞時(shí)的 MWCNTs 濃度為無(wú)毒性時(shí)的最大值，即 200 μg/ml，在此基礎(chǔ)上通過(guò)改變場(chǎng)強(qiáng)、脈寬、脈沖個(gè)數(shù)，研究 MWCNTs 聯(lián)合 nsPEF 處理腫瘤細(xì)胞的劑量效應(yīng)，并建立細(xì)胞活性與單因素間的擬合公式。圖 5 顯示了場(chǎng)強(qiáng)、脈寬、脈沖個(gè)數(shù)等單因素對(duì)細(xì)胞活性的影響結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以柱狀圖和折線圖疊加在一起的方式展示，紅色折線(實(shí)線)和藍(lán)色折線(虛線)分別表示不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果變化趨勢(shì)。圖例中“–MWCNTs”和“+MWCNTs”分別指“不加 MWCNTs”以及“加 MWCNTs”。與不加 MWCNTs 的結(jié)果相比，加入 MWCNTs 可以明顯降低細(xì)胞活性，但并沒(méi)有影響細(xì)胞活性隨單因素變化的下降規(guī)律。圖 5(a)表明，當(dāng)固定脈寬 300 ns、脈沖個(gè)數(shù) 100 個(gè)時(shí)，細(xì)胞活性隨場(chǎng)強(qiáng)呈現(xiàn) S 型衰減;圖 5(b)表明，當(dāng)固定場(chǎng)強(qiáng) 6 kV/cm、脈沖個(gè)數(shù) 100 個(gè)時(shí)，細(xì)胞活性隨脈寬呈現(xiàn) S 型衰減;圖 5(c)表明，當(dāng)固定場(chǎng)強(qiáng) 6 kV/cm、脈寬 300 ns 時(shí)，細(xì)胞活性隨脈沖個(gè)數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)型衰減。

　　為了更清晰地表明并且預(yù)測(cè)細(xì)胞活性隨各個(gè)脈沖參數(shù)的變化趨勢(shì)，采用 logistic 回歸模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以得到細(xì)胞活性的輸入輸出公式。 Logistic 回歸模型幾乎已經(jīng)成為流行病學(xué)和醫(yī)學(xué)中最常用的分析方法之一，尤其適合根據(jù)危險(xiǎn)因素預(yù)測(cè)某疾病發(fā)生的概率。Cole 在研究微生物熱失活時(shí)針對(duì)細(xì)菌存活率隨熱處理時(shí)間呈 S 型曲線下降的趨勢(shì)提出了對(duì)應(yīng)的 logistic 模型[14]，此模型也適用于指數(shù)衰減型曲線的擬合，相關(guān)公式為：  0 10 1 exp(4 ( log ( ))/( )) 10 t t S t             (1)其中，t 為自變量，S´為觀察到的生物學(xué)效應(yīng)，參數(shù) α 和分別代表曲線上漸近線(t=0)和下漸近線(t→∞)對(duì)應(yīng)的細(xì)菌存活率的對(duì)數(shù)，δ 和 t0 分別表示曲線的最大斜率以及最大斜率所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)位置。根據(jù)圖 5 所示結(jié)果，細(xì)胞活性在脈沖參數(shù)為低劑量時(shí)幾乎沒(méi)有變化，接近于 100，即曲線上漸近線為 100，所以 α 的值可以由下式計(jì)算得出： 10    log (100) 2 (2)修正后的 logistic 模型公式為：  0 10 2 2 1 exp(4 ( log ( ))/( 2)) 10 t t S t           (3)公式(3)中的參數(shù)含義與公式(1)一致。利用 Matlab 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一元非線性擬合可以得到公式(3)中三個(gè)未知參數(shù)的最優(yōu)值以及擬合準(zhǔn)確度 R 2，從而可以確定曲線的函數(shù)關(guān)系式，對(duì)應(yīng)的擬合曲線和 R 2 見(jiàn)圖 6。紅色曲線(實(shí)線)和藍(lán)色曲線(虛線)分別代表用 logistic 模型對(duì)不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合得到的曲線。R 2 被用來(lái)評(píng)價(jià)模型的擬合準(zhǔn)確度，其介于 0 到 1 之間，越接近于 1，說(shuō)明所選模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的匹配度越高。

　　由各曲線的 R 2 可知，采用 logistic 模型可以較為準(zhǔn)確地描述實(shí)驗(yàn)規(guī)律。圖 6 表明，細(xì)胞活性隨場(chǎng)強(qiáng)、脈寬變化時(shí)具有閾值效應(yīng)，即在低脈沖劑量下，細(xì)胞活性幾乎不變，當(dāng)脈沖劑量高于某個(gè)閾值后，細(xì)胞活性開(kāi)始急劇下降，并且在下降到一定程度后開(kāi)始飽和。相比之下，細(xì)胞活性隨脈沖個(gè)數(shù)的增加沒(méi)有明顯的閾值變化點(diǎn)，但是也會(huì)隨著脈沖個(gè)數(shù)的增加出現(xiàn)飽和趨勢(shì)。

　　2.3 細(xì)胞活性與多因素間的歸一化關(guān)系

　　為了進(jìn)一步分析有無(wú) MWCNTs 時(shí)場(chǎng)強(qiáng)、脈寬、脈沖個(gè)數(shù)三個(gè)參數(shù)與細(xì)胞活性的綜合關(guān)系，假設(shè)細(xì)胞活性 S´與注入的脈沖能量密度 σE2 τN 有關(guān)，σ 為細(xì)胞懸液的電導(dǎo)率，當(dāng) σ 為一定值時(shí)：    0.5 S F E N  (4)式中，F(xiàn) 為 E(τN) 0.5 的函數(shù)。以脈沖注入能量 E(τN) 0.5 為橫坐標(biāo)，細(xì)胞活性為縱坐標(biāo)，繪出如圖 7 所示的散點(diǎn)圖，脈沖注入能量為 0 時(shí)即為對(duì)照組。圖 7 中紅色曲線(實(shí)線)與藍(lán)色曲線(虛線)代表的含義與圖 6 類(lèi)似。圖 7 表明，不論有無(wú) MWCNTs，細(xì)胞活性與脈沖注入能量 E(τN) 0.5之間整體呈現(xiàn) S 型的變化規(guī)律。即當(dāng)脈沖注入能量很小且未達(dá)到所需的能量閾值時(shí)，基本不影響細(xì)胞活性;當(dāng)脈沖注入能量超過(guò)閾值點(diǎn)時(shí)，細(xì)胞活性開(kāi)始出現(xiàn)急劇下降，最后穩(wěn)定在某一飽和值，此時(shí)細(xì)胞活性隨脈沖注入能量的增大幾乎沒(méi)有變化。

　　基于 logistic 模型，得到細(xì)胞活性 S´與脈沖注入能量 E(τN) 0.5 的擬合曲線，如圖 7 所示。表 2 為對(duì)應(yīng)擬合曲線的參數(shù)最優(yōu)值及擬合度。 由 logistic 模型中參數(shù) ω 的物理含義可得，細(xì)胞活性在不加 MWCNTs 和加 MWCNTs 時(shí)所達(dá)到的飽和值分別為 10 0.559 9=3.63 和 10 0.538 6=3.46，兩者之間并無(wú)明顯區(qū)別，均近似為 3.5。細(xì)胞活性閾值約為 90(曲線下降階段距離上漸近線 10%的位置)，飽和值約為 12(曲線下降階段距離下漸近線 10%的位置)[15]。細(xì)胞活性在不加 MWCNTs 以及加 MWCNTs 的情況下達(dá)到閾值所需要的注入劑量分別為 654 和 540，達(dá)到飽和值所需要的注入劑量分別為 1 190 和 912。即 MWCNTs 的引入可以同時(shí)減小殺傷細(xì)胞所需的起始能量閾值和飽和能量值。

　　3 討論

　　3.1 不同濃度 MWCNTs 對(duì)細(xì)胞活性的影響

　　不同濃度MWCNTs的毒性實(shí)驗(yàn)表明，MWCNTs 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有劑量依賴(lài)性，即MWCNTs濃度越高，毒性越強(qiáng)。需要注意的是，除了MWCNTs，在碳納米管的制備過(guò)程中，還殘留有少量的催化劑和非離子表面活性劑[9,16]。其中，非離子表面活性劑主要用于解決碳納米管的團(tuán)聚問(wèn)題。研究表明， MWCNTs的毒性主要由殘留催化劑以及分散劑造成，并且殘留物的濃度越高，對(duì)細(xì)胞活性的影響越明顯[17,18]，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。

　　3.2 細(xì)胞活性隨不同脈沖參數(shù)的變化規(guī)律

　　細(xì)胞在正常的生理機(jī)能狀況下，由于其膜的選擇通透性會(huì)阻止大分子物質(zhì)的通過(guò)，從而維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的平衡。但是當(dāng)細(xì)胞暴露于電場(chǎng)中，電荷會(huì)向細(xì)胞膜兩側(cè)積累，形成跨膜電位。當(dāng)跨膜電位超過(guò)細(xì)胞膜的絕緣強(qiáng)度時(shí)，細(xì)胞膜上會(huì)產(chǎn)生微孔 [19]，打破細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的平衡，從而影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)狀態(tài)。對(duì)于單個(gè)球形細(xì)胞，不可逆電穿孔所需要的外加場(chǎng)強(qiáng)閾值Et可以表示為[20]：

　　E d (5)其中，Δφ 為細(xì)胞膜閾值跨膜電位，d 是球形細(xì)胞的直徑，θ 是細(xì)胞膜上特定位置的法線方向與外加電場(chǎng) E 方向的夾角。除了外加電壓要達(dá)到閾值，電穿孔現(xiàn)象是否可以發(fā)生還取決于脈沖持續(xù)時(shí)間[21]。如果施加的脈沖電壓持續(xù)時(shí)間太短，在脈沖電場(chǎng)撤去后細(xì)胞膜兩側(cè)的電荷分布會(huì)重新恢復(fù)到初始狀態(tài)，無(wú)法產(chǎn)生電穿孔效應(yīng)。球形細(xì)胞達(dá)到閾值跨膜電位所需要的最短脈沖持續(xù)時(shí)間 τ´(時(shí)間常數(shù))為[22]： 2 1 ( ) 2 Cd     (6) ρ1 和 ρ2 分別為細(xì)胞外液和細(xì)胞質(zhì)的電阻率，C 為細(xì)胞膜的等效電容。綜上所述，根據(jù)電穿孔原理可知，電穿孔效應(yīng)的產(chǎn)生不僅要求外加電壓超過(guò)一定閾值，還要求脈寬達(dá)到細(xì)胞膜的充電時(shí)間常數(shù)。這也解釋了圖 6 中為 什 么 當(dāng) 場(chǎng) 強(qiáng) 或 者 脈 寬 過(guò) 低 時(shí) ， 不 論 有 無(wú) MWCNTs，nsPEF 幾乎對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響，從而細(xì)胞活性隨場(chǎng)強(qiáng)和脈寬的增加均呈現(xiàn) S 型變化。細(xì)胞活性隨脈沖個(gè)數(shù)的變化幾乎沒(méi)有閾值效應(yīng)，而是呈現(xiàn)指數(shù)型變化，主要是因?yàn)楫?dāng)改變脈沖個(gè)數(shù)時(shí)，場(chǎng)強(qiáng)和脈寬的固定值達(dá)到了電穿孔所需要的閾值。脈沖個(gè)數(shù)越多，脈沖電場(chǎng)造成的細(xì)胞穿孔狀態(tài)維持時(shí)間越久，細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換越充分，也越容易破壞細(xì)胞的生存環(huán)境，從而造成細(xì)胞死亡。

　　3.3 MWCNTs 增強(qiáng) nsPEF 殺傷細(xì)胞效果的機(jī)制

　　CNTs是一種具有特殊結(jié)構(gòu)(徑向尺寸為納米級(jí)，軸向尺寸為微米級(jí)，管子兩端基本上都封口)的一維量子材料，主要由呈六邊形排列的碳原子構(gòu)成數(shù)層到數(shù)十層的同軸圓管。CNTs具有獨(dú)特的電學(xué)特性，呈現(xiàn)良好的金屬性(電導(dǎo)率約為104 S·cm-1)，研究表明，其載流能力是銅線的1 000倍[23]，使其可以在癌細(xì)胞附近形成三維導(dǎo)電基質(zhì)。將具有一維結(jié)構(gòu)的單根CNTs插入到幅值為E0的均勻電場(chǎng)區(qū)域中，會(huì)在CNTs的尖端產(chǎn)生場(chǎng)強(qiáng)增強(qiáng)效果。CNTs尖端的電場(chǎng)增強(qiáng)效果可以通過(guò)以下公式估算[24]： tip 0 E L E D  (7) Etip 為 CNTs 尖端的電場(chǎng)強(qiáng)度，β 是一個(gè)常數(shù)， L 和 D 分別表示 CNTs 的長(zhǎng)度和外徑，CNTs 的高縱橫比(L/D)解釋了為什么其可以很好地集聚場(chǎng)強(qiáng)，從而促進(jìn)電穿孔的效果。除此之外，研究表明處于電磁場(chǎng)中的 CNTs 還可以通過(guò)與細(xì)胞膜直接物理接觸對(duì)其產(chǎn)生機(jī)械破壞作用[11,25]。CNTs 在未施加電場(chǎng)之前將會(huì)因?yàn)槠浯蟊缺砻娣e和強(qiáng)烈的表面靜電作用隨機(jī)吸附到細(xì)胞膜周?chē)�，并且部�?CNTs 還會(huì)與細(xì)胞膜磷脂結(jié)合，此時(shí) CNTs 的存在對(duì)細(xì)胞形態(tài)無(wú)影響。但當(dāng)施加電場(chǎng)后， CNTs 會(huì)因?yàn)樵陔姶艌?chǎng)中受到極化作用而旋轉(zhuǎn)，直至與外加電場(chǎng)方向相同，在 CNTs 的旋轉(zhuǎn)過(guò)程中，其尖端受到的介電泳力將因?yàn)闄C(jī)械作用引起細(xì)胞膜變形和穿孔。總之，CNTs 的局部電場(chǎng)增強(qiáng)能力和物理破壞能力可以有效提高 nsPEF 殺傷癌細(xì)胞的效果。

　　4 結(jié)論

　　本文，我們?cè)诖_定 MWCNTs 安全濃度的基礎(chǔ)上探究了 MWCNTs 聯(lián)合 nsPEF 影響離體 A375 細(xì)胞活性的劑量效應(yīng)。細(xì)胞活性隨各個(gè)脈沖參數(shù)的變化整體呈現(xiàn)劑量越大，活性越低的規(guī)律。細(xì)胞活性隨場(chǎng)強(qiáng)、脈寬的變化具有閾值效應(yīng)，但是隨脈沖個(gè)數(shù)的變化卻沒(méi)有明顯的閾值效應(yīng)，并且隨各個(gè)脈沖參數(shù)的變化都呈現(xiàn)飽和效應(yīng)。細(xì)胞活性與脈沖能量密度的歸一化關(guān)系呈 S 型規(guī)律。具有良好電學(xué)特性和一維結(jié)構(gòu)的 MWCNTs 不影響上述變化規(guī)律，但是可以顯著增強(qiáng) nsPEF 對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，對(duì)提高臨床治療過(guò)程中的電氣安全性具有重要意義。

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　　納秒脈沖電場(chǎng)聯(lián)合多壁碳納米管對(duì)皮膚癌細(xì)胞活性的劑量效應(yīng)研究相關(guān)論文期刊你還可以了解：《分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào)生物學(xué)報(bào)征稿》