金銀花為常用大宗中藥材，來源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或待初開的花，自1963年為歷版《中國藥典》所收載。金銀花具有清熱解毒，疏散風熱之功效，用于癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫病發(fā)熱等[1]。

　　[摘要]為了探討硫磺熏蒸金銀花中斷馬錢子酸亞硫酸衍生物的生成機制，該研究采用柱色譜技術(shù)從未硫熏金銀花中目標性制備分離了斷馬錢子酸以進行后續(xù)模擬反應(yīng)，斷馬錢子酸在有水條件下與二氧化硫反應(yīng)生成了其亞硫酸衍生物，反應(yīng)機制可能涉及了斷馬錢子酸的酯化反應(yīng)或者是酸化開環(huán)后亞硫酸根對羰基的加成反應(yīng)。該研究為支持硫磺熏蒸導(dǎo)致金銀花中斷馬錢子酸轉(zhuǎn)變成其亞硫酸衍生物提供了實驗依據(jù)。

　　[關(guān)鍵詞]藥學(xué)論文,硫磺熏蒸,金銀花,斷馬錢子酸

　　其化學(xué)成分包括揮發(fā)油、酚酸（主要為綠原酸及其衍生物）、環(huán)烯醚萜（斷馬錢子酸、馬錢苷、當藥苷及其衍生物）和黃酮類（蘆丁、木犀草苷等）。現(xiàn)代藥理研究表明金銀花具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力、解熱抗炎和利膽保肝等作用[2]。傳統(tǒng)的產(chǎn)地加工方法有曬干和陰干，現(xiàn)代加工方法有烘干、水蒸氣干燥、熱風干燥以及熱風-微波聯(lián)用等，1995年版《中國藥典》曾收載過硫磺熏蒸的處理方法，在2000年版之后的《中國藥典》均取締了該產(chǎn)地加工方法，然而，在某些主產(chǎn)區(qū)，有時仍會采用硫磺熏蒸以獲得良好的外觀色澤和防止蟲蛀。前期研究表明硫磺熏蒸能夠?qū)е陆疸y花中環(huán)烯醚萜類主成分斷馬錢子酸1的含量降低，同時生成其亞硫酸衍生物2～4[3]，見圖1。斷馬錢子酸是一種分子結(jié)構(gòu)中具有半縮醛羥基的環(huán)烯醚萜類成分，為金銀花含有的環(huán)烯醚萜類物質(zhì)中的主要成分[4]，含量遠遠高于馬錢苷和當藥苷及其二聚產(chǎn)物，其含量的變化有可能會引起金銀花與環(huán)烯醚萜類成分相關(guān)的藥理活性的改變，譬如抗炎、抗病毒、保肝利膽等。為了進一步驗證硫熏金銀花中斷馬錢子酸亞硫酸衍生物的生成機制，該研究采用柱色譜技術(shù)從未熏金銀花中目標性制備斷馬錢子酸作為反應(yīng)底物，將其在有水條件下與SO2反應(yīng)，TLC和HPLC監(jiān)測反應(yīng)進程，基于LC-MS提供的質(zhì)譜信息，與文獻數(shù)據(jù)比對，鑒定生成的化合物結(jié)構(gòu)。

　　1材料

　　ShimadzuLC-20A高效液相色譜儀（日本島津）、Agilent1200-6130系列液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（AgilentTechnologies）、大容量冷凍離心機（DL-6MB，長沙英泰儀器有限責任公司）、SIGMA1-14小型離心機（Germany）、EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）、裕華HH-S型水浴鍋（鞏義市裕華儀器有限責任公司），HZ85-1型磁力攪拌器（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、三口瓶、雙連球等。

　　色譜甲醇、色譜乙腈（Fisher，USA），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司），其他試劑均為分析純。

　　新鮮的金銀花于2012年5月采自山東濟南，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所王智民研究員鑒定為忍冬科植物忍冬L.japonica的花蕾。曬干樣品：新鮮金銀花攤開晾曬于太陽下至干燥即得；硫磺熏蒸樣品：新鮮金銀花攤開放于支架上的透氣金屬網(wǎng)篩中（不宜太厚），支架下端用鐵質(zhì)器具裝入一定量硫磺粉末，點燃硫磺粉末出現(xiàn)藍紫色火焰，將整個裝置用塑料布密封，使硫磺黃色煙霧充滿裝置，熏制過夜，熏制后的金銀花晾于陰涼處，陰干即得。

　　2方法與結(jié)果

　　2.1斷馬錢子酸的分離制備

　　前期研究表明，曬干金銀花樣品中斷馬錢子酸的含量較高[3]，因此選擇曬干樣品進行該化合物的目標性分離制備。干燥的金銀花樣品（粉碎，311g）用17L50%乙醇滲漉提取，滲漉液回收溶劑至無醇味（約2300mL），離心（3500r・min-1，20min），上清液（約2100mL）上HPD-100大孔吸附樹脂柱，依次用5倍柱體積的水，10%，20%，30%，40%，95%乙醇洗脫，TLC和HPLC進行流分檢查，20%，30%乙醇洗脫部分富集斷馬錢子酸，合并后得10.3g固體粉末，上硅膠柱（300～400目，氯仿-甲醇-水15∶4∶0.4）進行粗分，ODS柱純化（10%甲醇洗脫），得到單體化合物（277mg）。經(jīng)HPLC面積歸一化法檢測其純度為94%；經(jīng)HPLC比對保留時間，在線紫外吸收以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)，確證該化合物為斷馬錢子酸。曬干金銀花50%甲醇超聲提取液和斷馬錢子酸在同一色譜條件下的HPLC圖見圖2。KromasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為1.4%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～20min，3%～8%B；20～45min，8%～15%B；45～60min，15%～24%B；60～70min，24%～40%B），檢測波長254nm，流速1mL・min-1，進樣量10μL，柱溫30℃。

　　2.2斷馬錢子酸在有水條件下與SO2反應(yīng)

　　新鮮的金銀花經(jīng)硫磺熏蒸后斷馬錢子酸1大部分被破壞，生成其亞硫酸衍生物2～4[3]，推測是斷馬錢子酸結(jié)構(gòu)中的半縮醛基團與熏蒸過程中硫磺燃燒產(chǎn)生的SO2在有水的條件下發(fā)生反應(yīng)所致；同時通過2007，2012年采集制備的硫磺熏蒸金銀花樣品的HPLC圖比對發(fā)現(xiàn)，在不同批次樣品中化合物2～4的含量比例不同[3，5]，推測是熏蒸過程中斷馬錢子酸與SO2接觸程度不同。因此，開展了以下實驗進行驗證。

　　2.2.1反應(yīng)1Na2S2O3溶液（3mol・L-1）與H2SO4（3mol・L-1）水浴40℃反應(yīng)生成的SO2氣體通入裝有20mL水的三角瓶中，待檢測到水溶液呈酸性（pH=1）時加入斷馬錢子酸固體粉末20mg，磁力攪拌器不斷攪拌，使之混合均勻，密封保溫放置15h，回收溶劑至干，甲醇復(fù)溶，按照2.1項下的HPLC條件進行檢測，產(chǎn)生了化合物2，3，見圖3。2.2.2反應(yīng)2在斷馬錢子酸水溶液（1g・L-1）中通入由Na2S2O3溶液（1mol・L-1）與H2SO4（3mol・L-1）水浴40℃生成的SO2氣體，每隔1h取樣200μL，按照2.1項下的HPLC條件進行檢測，反應(yīng)底物斷馬錢子酸與產(chǎn)物的HPLC圖見圖4，兩者峰面積隨時間的變化見圖5，5h后斷馬錢子酸完全轉(zhuǎn)化成為化合物2。

　　2.2.3反應(yīng)3在斷馬錢子酸水溶液（3g・L-1）中通入由Na2S2O3（固體）與H2SO4（濃）水浴40℃生成的SO2氣體，每隔2min取樣200μL，按照2.1項下的HPLC條件進行檢測，反應(yīng)底物斷馬錢子酸與反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖見圖6，兩者峰面積隨時間的變化見圖7，2min后斷馬錢子酸完全轉(zhuǎn)化成為化合物2。

　　2.2.4亞硫酸衍生物的HPLC和LC-MS確認基于相同色譜條件下HPLC-DAD分析提供的保留時間和在線紫外全波長光譜，與文獻比對，反應(yīng)1生成了亞硫酸衍生物2，3。由于化合物2非常不穩(wěn)定，在回收去除溶劑的過程中會轉(zhuǎn)變?yōu)槊揝O2的產(chǎn)物（tR=46～48min），反應(yīng)2和3采用反應(yīng)后直接進行HPLC分析，只檢測到化合物2生成。除了保留時間和在線紫外光譜，負離子模式下的液質(zhì)聯(lián)用分析也提供了化合物2的準分子離子峰455[M-H]-和911[2M-H]-以及碎片離子峰373[M-SO2-H2O-H]-，與文獻數(shù)據(jù)一致[3]。

　　3討論

　　斷馬錢子酸是一種分子結(jié)構(gòu)中具有半縮醛羥基的環(huán)烯醚萜類成分，曾經(jīng)從忍冬科金銀花L.japonicaThunb.、藍果忍冬L.coeruleaLinn.和長白忍冬L.ruprechtianaRegel等植物中分離得到，在不同批次曬干和硫熏金銀花中的質(zhì)量分數(shù)分別為0.79%～2.63%，0.20%～1.25%（未發(fā)表數(shù)據(jù)），為金銀花中環(huán)烯醚萜類物質(zhì)中的主要成分，其含量的變化有可能會引起金銀花與環(huán)烯醚萜類成分相關(guān)的藥理活性的改變，比如抗炎、抗病毒、保肝利膽等。由于該物質(zhì)水溶性強，缺少市售對照品的供應(yīng)，本研究探索了從曬干金銀花中富集、制備該成分的工藝流程，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、批量制備該物質(zhì)，為后續(xù)反應(yīng)進行提供了物質(zhì)保障。

　　Braverman等報道了硫熏食品中普遍存在SO2與糖類物質(zhì)的反應(yīng)，與開鏈醛糖反應(yīng)涉及了亞硫酸根對羰基的加成反應(yīng)，而與環(huán)狀半縮醛糖類的反應(yīng)涉及酸脫羥基醇脫氫的酯化反應(yīng)[6-7]。在2.2.1項中，斷馬錢子酸粉末加入到SO2的水溶液中，固體粉末在溶解的過程中即與亞硫酸反應(yīng)，產(chǎn)生了化合物2和3，說明此過程既有半縮醛羥基的酯化反應(yīng)，也有斷馬錢子酸先水解后產(chǎn)生開鏈醛糖中間體，然后涉及亞硫酸根對羰基的加成反應(yīng)，推測的反應(yīng)歷程見圖8。2.2.2和2.2.3項表明，若將斷馬錢子酸先溶于水，然后不間斷通入SO2氣體，只有化合物2產(chǎn)生，說明斷馬錢子酸在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，易發(fā)生水解，內(nèi)酯環(huán)開裂，與亞硫酸的反應(yīng)只涉及了上述第二種反應(yīng)歷程；并且反應(yīng)完全受控于SO2氣體的通入速度和量。硫代硫酸鈉與稀硫酸反應(yīng)時，SO2產(chǎn)生緩慢，斷馬錢子酸與亞硫酸反應(yīng)完全需經(jīng)歷5h；硫代硫酸鈉與濃硫酸反應(yīng)時，SO2產(chǎn)生迅速，斷馬錢子酸與亞硫酸反應(yīng)完全僅需要2min。

　　在斷馬錢子酸與亞硫酸的反應(yīng)中，未檢測到硫熏金銀花中另外一個主要衍生物4的生成，推測其可能的原因有二：①新鮮的金銀花在硫磺熏蒸過程中，復(fù)雜的組織環(huán)境和豐富的酶系統(tǒng)使化合物2或

　　3進一步甲酯化產(chǎn)生了化合物4，而該研究采用斷馬錢子苷與SO2水溶液反應(yīng)，不能完全反映硫磺熏蒸金銀花的復(fù)雜過程；②金銀花中含具有開鏈醛基的化合物開鏈馬錢子苷，它在硫熏過程中與亞硫酸發(fā)生加成反應(yīng)，產(chǎn)生化合物4。

　　新鮮的金銀花含水量較大，經(jīng)過硫磺熏蒸而富含亞硫酸，其中的主要環(huán)烯醚萜類成分斷馬錢子酸在酸性環(huán)境中不穩(wěn)定，與亞硫酸反應(yīng)生成其相應(yīng)的衍生物，該研究為揭示上述硫磺熏蒸機制提供了進一步的實驗依據(jù)。

　　近年來越來越多的研究表明硫磺熏蒸不僅導(dǎo)致二氧化硫殘留量超標，而且能夠改變其中的化學(xué)成分及其生物活性，比如白芍熏蒸導(dǎo)致芍藥苷和苯甲酰芍藥苷含量降低，生成其相應(yīng)的亞硫酸衍生物[8-9]，生曬參熏蒸導(dǎo)致人參皂苷含量降低，生成其亞硫酸鈉衍生物[10]，白芷熏蒸導(dǎo)致其中取代的呋喃香豆素水解成苷元[11]，菊花熏蒸導(dǎo)致黃酮苷水解成其相應(yīng)苷元[12]等。本研究為開展上述其他中藥硫磺熏蒸導(dǎo)致化學(xué)變化的反應(yīng)機制研究提供了參考。

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