宜昌潤楠(Machilus ichangensis)屬樟科(Lauraceae)潤楠屬(Machilus)毛花組中的黃心樹亞組[1]常綠闊葉喬木，是中國特有珍稀植物，產(chǎn)于湖北、四川、陜西、甘肅，生長在海拔560～1 400 m的山坡或山谷的疏林內(nèi)。宜昌潤楠不僅樹干通直，樹姿優(yōu)美，是良好的觀賞綠化樹種，且其木材優(yōu)良，樹皮可作褐色染料，種子油可制肥皂、潤滑油等，具有潛在的輕工業(yè)利用前景。

　　摘要：宜昌潤楠(Machilus ichangensis)屬樟科(Lauraceae)潤楠屬(Machilus)植物，常綠喬木，是中國傳統(tǒng)的珍貴優(yōu)質(zhì)用材樹種。對宜昌潤楠的大、小孢 子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育過程進(jìn)行了詳細(xì)的細(xì)胞學(xué)觀察。結(jié)果表明，宜昌潤楠的雌蕊子房1室，單胚珠，倒生，雙珠被，厚珠心。大孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成直 線形排列的4個(gè)大孢子，合點(diǎn)端的發(fā)育成功能大孢子，其余3個(gè)退化，胚囊發(fā)育類型為蓼型。雄蕊花藥多為二室，少三室、四室花藥，變形絨氈層，小孢子四分體排 列為四面體型，成熟花粉為二胞花粉。小孢子有少量敗育及不育現(xiàn)象，雄性不育株絨氈層細(xì)胞延遲降解，使小孢子得不到營養(yǎng)而不能正常發(fā)育，最后敗育。

　　關(guān)鍵詞：論文發(fā)表最好的網(wǎng)站,宜昌潤楠(Machilus ichangensis),大、小孢子發(fā)生,雌、雄配子體發(fā)育,敗育

　　The Megasporogenesis，Microsporogenesis，F(xiàn)emale and Male Gametophyte Development of Machilus ichangensis

　　HAN Yi-yang1，LI Li-ping1，CHEN Fa-ju1，YANG Lin-sen2，LIANG Hong-wei1

　　(1.Biotechnology Research Center，China Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China;

　　2.Bureau of Shennongjia National Nature Reserve，Shennongjia 442421，Hubei，China)

　　Abstract： Machilus ichangensis Rehd.et Wils is an unique high-quality timber species belonging to Lauraceae Machilus. The megasporogenesis，microsporogenesis and development of male and female gametophytes in the flower of Machilus ichangensis were observed at cellular level. The results showed that the ovary of Machilus ichangensi had 1-locules，with single ovule.The ovule was anatropous，bitegmic and crassinucellate with the endothelium.The megaspore mother cell formed a linear tetrad of 4 megaspores after meiosis. The chalazal megaspore developed the functional one and the other 3 at the micropylar pole were degraded. The development of embryo sac was of polygonum type. There were 2-locules，3-locules and 4-locules anther sac in flowers. The tapetum was amoeboid. The microspores tetrad was arranged in a tetrahedral. The mature pollen grains were of 2-celled types. There were little pollen abortion and male sterility since the tapetum of male sterile plants delayed degradation and the microspores could not obtain enough nutrition for normal development.

　　Key words：Machilus ichangensis;megasporogenesis and microsporogenesis;male and female gametophytes development;abortion

　　對宜昌潤楠的研究目前僅限于生理生態(tài)[2，3]、化學(xué)成分[4]的研究，更多的是關(guān)于潤楠屬[5-7]、潤楠 [8-12] 的分類及雄配子體超微結(jié)構(gòu)的研究。而對宜昌潤楠鮮有報(bào)道。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，對宜昌潤楠花發(fā)育過程中，大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體的形成過程進(jìn)行了詳細(xì)的細(xì)胞學(xué)觀察和研究，旨在為該種資源保護(hù)、良種繁育和系統(tǒng)進(jìn)化研究提供生殖生物學(xué)方面的基礎(chǔ)資料。

　　1材料與方法

　　用于細(xì)胞學(xué)研究的宜昌潤楠花芽材料采自湖北省五峰縣仁和坪鎮(zhèn)。將不同發(fā)育時(shí)期的宜昌潤楠花芽固定于FAA固定液中，固定24 h后轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存在4 ℃冰箱備用。采用常規(guī)石蠟切片法切片。Laica切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚度為8 μm。番紅、固綠對染法進(jìn)行染色，逐級脫水透明封片，Nikon ECLIPSE 80i型顯微鏡觀察照相。 　　2結(jié)果與分析

　　2.1小孢子發(fā)生及雄配子體的形成

　　2.1.1花藥壁的發(fā)育宜昌潤楠為圓錐花序，從花藥橫切面看，雄蕊9枚，外輪6枚，內(nèi)輪3枚(圖1-11)。宜昌潤楠的花藥有2室花粉囊、3室 花粉囊和4室花粉囊，且2室花粉囊居多，有一字型排列花粉囊和蝶形花粉囊(圖1-14)。在小孢子造孢細(xì)胞時(shí)期，花藥壁開始分化，依次形成表皮、藥室內(nèi) 壁、2～3層中層和絨氈層，細(xì)胞之間排列緊密(圖1-2)。隨著次生造孢細(xì)胞的發(fā)育，花藥壁層次清晰，且絨氈層質(zhì)濃(圖1-3)。當(dāng)小孢子母細(xì)胞形成時(shí)， 絨氈層細(xì)胞體積變大，質(zhì)濃，細(xì)胞形狀規(guī)則，排列緊密，且中層在早期呈現(xiàn)出退化趨勢(圖1-4)。在小孢子四分體時(shí)期及剛釋放的小孢子時(shí)期，絨氈層開始脫離 花藥壁，細(xì)胞之間排列疏松，此時(shí)中層只剩殘跡，表皮細(xì)胞與藥室內(nèi)壁細(xì)胞仍緊密排列，方形(圖1-6)。在小孢子變圓的階段，小孢子周圍出現(xiàn)周原生質(zhì)團(tuán)(圖 1-7，圖1-9)，包裹著每個(gè)小孢子，故宜昌潤楠的絨氈層屬于變形絨氈層。當(dāng)小孢子發(fā)育成熟時(shí)，周原質(zhì)團(tuán)已被吸收殆盡，中層仍留殘跡，藥室內(nèi)壁開始纖維 化，表皮緊貼藥室內(nèi)壁(圖 1-10)。散粉時(shí)期，花藥從兩側(cè)開裂，花藥壁脫落(圖1-13)。

　　2.1.2小孢子發(fā)生及雄配子體的形成 在花粉囊壁發(fā)育的同時(shí)，宜昌潤楠的初生造孢細(xì)胞發(fā)育為次生造孢細(xì)胞，次生造孢細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞排列緊密，核大，質(zhì)濃，有較大液泡位于細(xì)胞中央(圖 1-2)。緊接著次生造孢細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育為小孢子母細(xì)胞，形狀變圓，質(zhì)濃，細(xì)胞核被液泡擠向一邊(圖1-4)。隨后小孢子母細(xì)胞進(jìn)行1次減數(shù)分裂，形成正 四面體形四分體，排列緊密(圖1-5)。四分體釋放的小孢子形狀不規(guī)則，被原生質(zhì)團(tuán)絨氈層包圍，隨后小孢子體積開始增大，形狀變圓。在雄配子體發(fā)育的過程 中，有花粉敗育現(xiàn)象，敗育的花粉細(xì)胞質(zhì)空癟，最后只剩下空的花粉壁(圖1-7)。可育花粉細(xì)胞圓潤，單核期細(xì)胞質(zhì)濃，周圍外壁仍有胼胝質(zhì)，小孢子核經(jīng)過一 次有絲分裂，形成成熟的二核花粉，被液泡擠向一邊的核叫生殖核，位于細(xì)胞中央較大的核為營養(yǎng)核(圖1-12)。在切片時(shí)發(fā)現(xiàn)宜昌潤楠少量的雄性不育現(xiàn)象， 在四分體釋放小孢子后，絨氈層不能脫離花粉囊壁，細(xì)胞內(nèi)的自溶物不能及時(shí)為小孢子提供營養(yǎng)，小孢子形狀線性，空癟(圖1-15)，最后與絨氈層一起降解， 形成一條顏色很深的帶(圖1-16)。

　　2.2大孢子發(fā)生及雌配子體的形成

　　宜昌潤楠子房一室，單胚珠，倒生，雙珠被，厚珠心。在早期的珠心組織中，珠心頂端表皮下3～4層細(xì)胞分化為2個(gè)孢原細(xì)胞，核大，質(zhì)濃(圖 2-1、圖2-2)。隨后孢原細(xì)胞經(jīng)過一次平周分裂形成一個(gè)造孢細(xì)胞和一個(gè)周緣細(xì)胞，但僅一個(gè)造孢細(xì)胞分化成為大孢子母細(xì)胞。由于胚珠兩側(cè)生長速度不一 致，不久一側(cè)分裂生長較快的發(fā)生彎曲，導(dǎo)致胚珠倒生，內(nèi)珠被生長快于外珠被(圖2-3)。大孢子四分體排列直線型(圖2-4)，且靠近合點(diǎn)端的一個(gè)成為功 能大孢子，其余3個(gè)退化。隨后功能大孢子先形成單核胚囊(圖2-5)，單核胚囊經(jīng)過3次有絲分裂分別形成二核胚囊(圖2-6)、四核胚囊(圖2-7)、八 核胚囊(圖2-8)。在雌配子體形成的過程中，囊腔逐漸擴(kuò)大，在成熟胚囊時(shí)達(dá)到最大(圖2-4～9)。由于胚囊中的細(xì)胞并不位于同一平面，所以在不同的切 片中才能觀察到特殊細(xì)胞。位于珠孔端的卵細(xì)胞體積最大，核大，質(zhì)濃(圖 2-9)，與2個(gè)助細(xì)胞成梨形狀(圖2-10)。中央極核位于胚囊中央(圖2-11)，反足細(xì)胞位于合點(diǎn)端，3個(gè)細(xì)胞構(gòu)成“品”字形排列。

　　3討論

　　宜昌潤楠為樟科潤楠屬，其胚胎學(xué)特征基本上與樟科和潤楠屬的胚胎學(xué)特征相符合。胚珠倒生，雙珠被，厚珠心，大孢子四分體直線型，靠近合點(diǎn)端發(fā)育 為功能大孢子，胚胎發(fā)育為蓼型，與樟科基本特征一致[13-16]。在郭建民等[8]的潤楠屬胚胎學(xué)的報(bào)道中孢原細(xì)胞起源于珠心表皮3～4層細(xì)胞之下，且 雌性孢原細(xì)胞多個(gè)相一致。樟科植物的絨氈層有腺質(zhì)絨氈層，也有變形絨氈層[13]。而潤楠屬[9，12]與宜昌潤楠的切片中都表現(xiàn)出變形絨氈層的特征，在 四分體解體后絨氈層細(xì)胞向藥室腔內(nèi)移動，在小孢子周圍形成周原質(zhì)團(tuán)。基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征，花藥室數(shù)目曾經(jīng)被作為樟科分類依據(jù)，而現(xiàn)在花藥數(shù)目是一個(gè)可變而 缺乏穩(wěn)定的形態(tài)特征，同一屬內(nèi)的不同種類間藥室數(shù)目也是不穩(wěn)定的[17]。在Kweon等[13，14]對樟科的報(bào)道中指出花藥有2室和4室，取決于哪個(gè) 屬哪個(gè)科，未見3室報(bào)道。而在宜昌潤楠中，一朵花中同時(shí)存在2室、3室、4室花粉囊，以2室花粉囊居多。這可能跟取材的野生宜昌潤楠有關(guān)，在屬間或種間出 現(xiàn)了一定的變異。

　　從大量切片中觀察到，不同花的花粉囊或同一朵花中不同花粉囊發(fā)育不同步，在四分體解體后，同一花中的不同藥室發(fā)育高度同步。雌蕊與雄蕊的發(fā)育基 本同步。在連續(xù)切片中可以看到，小孢子在四分體及之前的時(shí)期，數(shù)量居多，在小孢子成熟的過程中，有部分?jǐn)∮�現(xiàn)象，細(xì)胞空癟，出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致花粉量的減 少，有性生殖能力降低。在部分花的發(fā)育中仍可見雄性不育現(xiàn)象，在小孢子從四分體釋放出來后，絨氈層沒有進(jìn)入到花粉囊中，而在原位延遲降解，導(dǎo)致小孢子過度 收縮變形，不能進(jìn)行正常的液泡化，不能正常地進(jìn)行有絲分裂而形成空的花粉囊。在雄性不育的報(bào)道中，絨氈層的異常通常是其普遍因素。高粱不育系[18]的花 藥絨氈層細(xì)胞存在過度發(fā)育和液泡化的異常現(xiàn)象;其次在玉米[19]、蘿卜[20]、水稻[21]等雄性不育細(xì)胞學(xué)研究中也均發(fā)現(xiàn)了絨氈層的遲緩消失等異常 現(xiàn)象。由此可見，絨氈層不能及時(shí)降解致使宜昌潤楠的雄蕊在分化過程中出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，使其繁殖能力低下，也是宜昌潤楠種群數(shù)量稀少的部分原因。可以進(jìn)一步通 過生物化學(xué)、分子生物學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)對其進(jìn)行探究，以探索制約宜昌潤楠自我更新繁育的其他關(guān)鍵環(huán)節(jié)和關(guān)鍵因子或?qū)ふ抑率蛊浣q氈層自身溶解延遲的相關(guān)基 因，從而通過人工干預(yù)，尋求提高該物種繁育能力的有效方法。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1] 中國科學(xué)院植物志編委.中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1982. 　　[2] 商衛(wèi)衛(wèi).宜昌潤楠的耐低溫生理研究[D].鄭州： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

　　[3] 黎明，楊芳絨，商衛(wèi)衛(wèi).低溫對宜昌潤楠生理指標(biāo)及葉片超微結(jié)構(gòu)的影響[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25(4)： 19-22.

　　[4] 程凡，徐幫，郭玲芝，等.宜昌潤楠中酚類成分的研究[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，46(6)： 695-699.

　　[5] 陳俊秋.樟科潤楠屬植物系統(tǒng)學(xué)研究[D].云南西雙版納： 中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，2008.

　　[6] 陳俊秋，李朗，李捷，等.樟科潤楠屬植物ITS序列貝葉斯分析及其系統(tǒng)學(xué)意義[J].云南植物研究，2009，31(2)： 117-126.

　　[7] 林夏珍，宣君華，秦瑋琳.浙江潤楠屬植物花粉形態(tài)的比較研究[J].福建林業(yè)科技，2009，36(2)： 58-62.

　　[8]郭建民.潤楠胚胎學(xué)的初步研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，1987 (4)： 118-126.

　　[9] 戴蕃?，戴大臨，郭建民，等.潤楠雄配子體超微結(jié)構(gòu)研究――花粉壁的形成[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1987(4)： 78-85.