固定化酶是酶工程的核心技術(shù)之一,有利于實(shí)驗(yàn)酶的重復(fù)使用及產(chǎn)物與酶的分離,將酶工程提高到一個(gè)新的水平,極大地促進(jìn)了酶工程的研究與應(yīng)用,并廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。綜述了固定化酶的制備方法,總結(jié)了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用,并對(duì)其的發(fā)展進(jìn)行了展望。

　　《食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)報(bào)》食品雜志，創(chuàng)刊于1983年，國(guó)內(nèi)外公開(kāi)發(fā)行�！妒称房茖W(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)報(bào)》宗旨是在立足原有的輕工行業(yè)特色的基礎(chǔ)上，以繁榮科學(xué)文化，促進(jìn)學(xué)術(shù)交流，促進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)水平提高以及發(fā)現(xiàn)和培養(yǎng)人才為辦刊宗旨，是以輕工類科學(xué)技術(shù)研究為主要特色的學(xué)術(shù)理論性刊物。

　　固定化酶技術(shù)是20世紀(jì)60年展起來(lái)的一項(xiàng)生物工程技術(shù)。酶的固定化(immobilization of enzymes)是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi),進(jìn)行特有的催化反應(yīng),并可回收及重復(fù)利用的技術(shù)[1]。固定化酶的研究不僅在化學(xué)生物學(xué)、生物工程醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)等領(lǐng)域異�；钴S,而且因?yàn)槠涔?jié)省能源與資源、減少污染的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)而符合可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略要求[2]。

　　1固定化酶的定義與特點(diǎn)

　　固定化酶技術(shù)是將酶用人工方法固定在特定載體上,進(jìn)行催化、生產(chǎn),因而固定化酶一般可以被認(rèn)為是不溶性酶。與水溶性酶相比,其優(yōu)點(diǎn)如下:易于將固定化酶與底物、產(chǎn)物分高,便于后續(xù)的分離和純化;可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)連續(xù)生產(chǎn);酶的穩(wěn)定性和最適溫度提高;酶反應(yīng)條件容易控制;可以增加產(chǎn)物的收率,提高產(chǎn)物質(zhì)量;酶的使用效率高,使用成本低;適于產(chǎn)業(yè)化、連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)。與此同時(shí),由于酶的分離、固定化處理等原因,固定化酶也具有一些難以避免的缺點(diǎn):在固定化過(guò)程中,酶活力會(huì)損失;生產(chǎn)成本提高,工廠初期投資大;只能用于水溶性底物,適合于小分子;不適宜于多酶反應(yīng),還需要需要輔助因子的協(xié)助才可以有效反應(yīng)[3-4]。

　　2固定化酶的方法

　　酶的固定方法主要有吸附法、包埋法、共價(jià)鍵合法和一些其他方法,針對(duì)不同的酶、不同的載體,需要采用不同的方法,有時(shí)還需要將幾種方法聯(lián)合使用。

　　2.1吸附法

　　吸附法是通過(guò)非特異性物理吸附法或生物物質(zhì)的特異吸附作用將酶吸附在炭、有機(jī)聚合物、玻璃、無(wú)機(jī)鹽、金屬氧化物或硅膠等材料上。該方法又分為物理吸附法和離子吸附法。此法簡(jiǎn)便,且酶變性的可能性較小。但是在酶和載體結(jié)合具有弱鍵的本質(zhì),在使用過(guò)程中易解吸,又由于載體具有非特異性吸附劑的本質(zhì),因此可能同時(shí)吸附除酶以外的其他物質(zhì)[4]。

　　2.2包埋法

　　包埋法是指酶或細(xì)胞包埋在各種多種載體(如聚丙烯酰胺凝膠、矽酸鹽凝膠、藻酸鹽、角叉菜聚糖等)中發(fā)生聚合、沉淀或凝膠化使之固定的方法。主要分為凝膠包埋法和微膠囊包埋法,該方法操作簡(jiǎn)單,酶活回收率較高,但發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí),酶易失活,適用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。

　　2.3結(jié)合法

　　結(jié)合法指選擇適宜的載體,使之通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定方法。包括離子鍵結(jié)合法和共價(jià)鍵結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法操作簡(jiǎn)單,條件溫和,酶活性損失少,但酶與載體結(jié)合力弱,酶易脫落,這也是最常用的方法之一。共價(jià)鍵結(jié)合法研究較為成熟,酶與載體結(jié)合牢固,一般不輕易脫落,但反應(yīng)條件較劇烈,會(huì)引起酶蛋白空間構(gòu)象的變化,破壞酶的活性部位。

　　2.4交聯(lián)法

　　交聯(lián)法是用雙功能試劑或多功能試劑進(jìn)行酶分子之間的交聯(lián),是酶分子和雙功能試劑或多功能試劑之間形成共價(jià)鍵,得到三向德交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外,還存在一定的分子內(nèi)交聯(lián)。根據(jù)使用條件和添加材料的不同,還能夠產(chǎn)生不同物理性質(zhì)的固定化酶。此法反應(yīng)條件較劇烈,酶活回收率很低,故不常用。一般將吸附法和交聯(lián)法2種方法結(jié)合起來(lái)使用。

　　3固定化酶在食品工業(yè)上的應(yīng)用

　　3.1固定化酶在柑橘汁加工中的應(yīng)用

　　柑桔加工產(chǎn)品出現(xiàn)過(guò)度苦味是柑桔加工業(yè)中較重要的問(wèn)題,苦味物質(zhì)主要由2類物質(zhì)組成:一類為檸檬苦素的二萜烯二內(nèi)酯化合物(A和D環(huán));另一類為果實(shí)中多種黃酮苷,其中柚皮苷為葡萄柚和苦橙等柑桔類果汁中的主要黃酮苷,柚皮苷的苦味與鼠李糖和葡萄糖連接鍵的分子構(gòu)象有關(guān)[5]。主要是利用不同的酶分別作用于檸檬苦素和柚皮苷生成不含苦味的物質(zhì)。Manjon等使用空心玻璃床作為載體,分別使DEAE-Sephadex和單寧-氨基乙基纖維(tanninamino ethy1 cellulose)作為載體;Puri等使用海藻糖;Soures等使用醋酸纖維和三醋酸纖維制成膜固定酶,其試驗(yàn)結(jié)果都表明用固定化酶處理后的果汁苦味明顯降低。

　　3.2固定化果膠酶在果汁加工中澄清的應(yīng)用

　　在果汁加工中,果膠的存在會(huì)使壓榨與澄清困難,而果膠酶是指分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱。Lozano等[6]將尼龍膜進(jìn)行O-烷基化活化后與果膠酶共價(jià)偶聯(lián),然后置于微濾反應(yīng)器中,被降解的小分子果膠隨濾膜流出,貯液粘度降低88.14 %,從而破壞果汁的膠體狀態(tài)。張來(lái)群等[7]將尼龍網(wǎng)經(jīng)3-二甲氨基丙胺活化后,用戊二醛共價(jià)偶聯(lián)果膠酶,所得固定化酶Km值與自然酶接近,在較寬的pH值范圍內(nèi)保持正�；盍�,對(duì)溫度的穩(wěn)定性有較大提高。Vaillant等[8]以蝦殼幾丁質(zhì)為載體,以戊二醛為偶聯(lián)劑共同固定PL和內(nèi)切纖維素酶,發(fā)現(xiàn)其半衰期為407 h。

　　3.3固定化酶在啤酒澄清中的應(yīng)用

　　啤酒以其清晰度高、泡沫適中、營(yíng)養(yǎng)豐富和口感好成為人們的最佳選擇。但是,由于啤酒中含有一定量的蛋白質(zhì),它與游離于啤酒中的多酚、單寧等結(jié)合產(chǎn)生不溶性膠體或沉淀,造成啤酒混濁,從而嚴(yán)重影響了啤酒的質(zhì)量。溫燕梅等[9]采用吸附—交聯(lián)法,使胰蛋白酶先吸附于磁性膠體粒子表面,后用戊二醛雙功能試劑交聯(lián),形成“酶網(wǎng)”裹著載體形成固定化酶,該磁性酶對(duì)啤酒澄清防止冷渾濁有明顯效果。趙炳超等[10]在戊二醛做交聯(lián)劑的條件下,以介孔分子篩MCm248作載體固定化木瓜蛋白酶,所得固定化酶的熱穩(wěn)定性有了顯著提高,固定化酶的pH值穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性也有了明顯改善。

　　3.4固定化酶在乳制品中的應(yīng)用

　　乳糖酶亦稱為β-半乳糖苷酶,是工業(yè)中應(yīng)用相當(dāng)廣泛的一種酶,較多地應(yīng)用于乳制品加工中。很多人小腸黏膜內(nèi)的乳糖酶活性嚴(yán)重降低,導(dǎo)致乳糖不耐受癥。用乳糖酶處理部分乳糖,分解為葡萄糖和半乳糖,可以減少這種癥狀。

　　楊君等[11]應(yīng)用海藻酸鈉—殼聚糖固定化乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵乳清飲料研究。結(jié)果表明,固定化乳酸菌產(chǎn)酸和耐酸能力強(qiáng),菌種活力持久并可多次重復(fù)利用。孫玉梅等[12]埋酵母乳糖酶間歇處理預(yù)先超高溫消毒的牛奶,用戊二醛處理環(huán)狀芽孢桿菌的乳糖酶,或把該菌用戊二醛交聯(lián)固定于多孔硅膠,經(jīng)處理或固定化后的乳糖酶,其生產(chǎn)活性從原來(lái)的21%提高至40%。李燕[13]用聚丙烯酰胺凝膠包埋米曲酶的乳糖酶,酶活力與機(jī)械強(qiáng)度都比較理想。固定化酶的穩(wěn)定性范圍擴(kuò)大,熱穩(wěn)定性提高,同時(shí)底物乳糖在凝膠中擴(kuò)散不影響固定酶的反應(yīng)速度。使用該固定化酶處理脫脂牛奶,可以在保持原有風(fēng)味的條件下,增加甜度,飲用時(shí)可減少蔗糖用量。

　　3.5固定化酶在制糖中的應(yīng)用

　　在制備低聚果糖中,Hayashi等[14]用多孔硅石吸附Aureo-basidium sp.的果糖基轉(zhuǎn)移酶,并用戊二醛交聯(lián)后裝柱可保留較高的酶活力。Hayashi等[15]用DEAE-纖維素固定果糖基轉(zhuǎn)移酶,酶活力可保留95%。Yun等將果糖基轉(zhuǎn)移酶固定在苯乙烯衍生的多孔離子交換劑上填入玻璃柱內(nèi),初始固定化酶的活性僅喪失8%。Chiang等[16]將Aspergillus niger和Aspergillus japoicus的果糖基轉(zhuǎn)移酶純化后共價(jià)結(jié)合在甲基丙烯酰胺高分子顆粒上,可保留酶活力達(dá)100%。

　　固定化葡萄糖異構(gòu)酶可以用來(lái)催化玉米糖漿和淀粉生產(chǎn)高甜度的高果糖糖漿。用淀粉生產(chǎn)高果糖漿包含3步:一是用淀粉酶液化淀粉;二是用糖化酶將其轉(zhuǎn)化為葡萄糖,即糖化;三是用葡萄糖異構(gòu)酶將葡萄糖異構(gòu)為果糖。由此可得到含高果糖漿與蔗糖同等甜度時(shí),其價(jià)格低10%~20%,具有經(jīng)濟(jì)推動(dòng)力。該固定化酶常用的制備技術(shù)是熱處理法,將含葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌、芽孢桿菌或鏈霉菌等細(xì)胞用60~65 ℃熱處理15 min,該酶就固定在菌體上制成固定化酶[17]。

　　3.6固定化酶在茶葉加工中的應(yīng)用

　　在茶葉中含有種類繁多的酶,如多酚氧化酶、過(guò)氧化酶、單寧酶、果膠酶等,其對(duì)茶葉的加工或深加工有重要的意義。對(duì)重要酶類的固定化研究,可有效地改善茶葉的品質(zhì)、拓展茶葉深加工的領(lǐng)域和應(yīng)用范圍。

　　多酚氧化酶是作為茶葉尤其是紅茶必不可少的一種酶,李榮林[18]等人利用海藻酸鈉包埋交聯(lián)后其活力保持不變,而且熱穩(wěn)定性和對(duì)酸堿的適應(yīng)性增強(qiáng)。單寧酶可以水解沒(méi)食子酸單寧中的酯鍵和縮酚酸鍵,將單寧酶應(yīng)用于茶飲料中可改善茶飲料的品質(zhì)。Lauren[19]報(bào)道用固定化的單寧酶處理紅茶,提高茶湯中可溶性鐵和鈣的含量。若在綠茶加工中使用單寧酶,可以部分消除夏秋茶的苦澀味道,提高茶飲料品質(zhì)。茶葉中的水溶性果膠物質(zhì),對(duì)于促進(jìn)紅茶的品質(zhì)具有積極作用。尹軍鋒等[20]用果膠酶對(duì)茶汁酶解作用進(jìn)行研究,得出了果膠酶能提高茶汁膜分離性能的結(jié)論。

　　3.7 固定化酶在煙葉中的應(yīng)用

　　在烤煙初烤和復(fù)烤后尚殘留淀粉,淀粉在燃吸時(shí)影響燃燒速度和燃燒完全性,并產(chǎn)生糊焦氣味,影響吸食品質(zhì)。在一定條件下淀粉能水解為水溶性糖,使煙質(zhì)改善。但這些反應(yīng)并不充分,處理后的煙葉中淀粉含量仍很高,特別是低次煙葉中較高的淀粉含量影響了該類煙葉的可用性。加酶處理能加速淀粉水解,能將直鏈淀粉迅速降解為糊精和麥芽糖等,糖化酶能將直鏈淀粉和支鏈淀粉降解為葡萄糖。劉謀盛等[21]將固定化α-2淀粉酶和糖化酶制成乳狀液,用以降低低檔次煙葉中淀粉的含量。由于酶被水溶性載體所形成的保護(hù)層包膜,避免了與空氣直接接觸,其活力得以提高,即強(qiáng)化了發(fā)酵條件,從而提高了卷煙的抽吸品質(zhì)。同時(shí),對(duì)固定化酶乳狀液添加劑與水溶液酶添加劑降低低檔次煙葉中淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,固定化酶處理煙葉淀粉降解率為25%~30%,優(yōu)于水溶液酶的25%,特別在抽吸品質(zhì)方面,前者處理明顯優(yōu)于后者處理。

　　3.8固定化酶在食品檢測(cè)以及傳感器中的應(yīng)用

　　生物傳感器被認(rèn)為是一種由受體、抗體或酶構(gòu)成的生物感應(yīng)層于換能器緊密連接而能提供環(huán)境組成信息的感應(yīng)器。如:測(cè)量電流以及電位的酶電極,酶熱敏電阻裝置,以場(chǎng)效應(yīng)管為基礎(chǔ)的生物傳感器,以及生物發(fā)光及化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)的纖維—光學(xué)傳感器等,不同的傳感器都應(yīng)用不同類型的固定化酶。

　　固定化葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅魇瞧渲袘?yīng)用最為廣泛的一種。1967年,Clark等[22]采用固定化酶技術(shù),把葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上再和氧電極結(jié)合,組裝成第1個(gè)酶電極—葡萄糖電極。唐芳瓊等[23]利用納米顆粒引入到葡萄糖電極研究中,并用易成膜的PVB作輔助膜基質(zhì),進(jìn)行GOD的固定化研究。試驗(yàn)結(jié)果表明,利用納米顆粒的表面效應(yīng)可以顯著提高GOD酶電極響應(yīng)靈敏度。目前,制藥廠將葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化氫酶與一種顯色劑一起固定在試紙上,制成檢驗(yàn)婦女是否妊娠的試紙。這種檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)單,操作方便,應(yīng)用極為廣泛。用聚丙烯酰胺包埋葡萄糖氧化酶與氧電極組裝成酶電極也可用來(lái)進(jìn)行臨床的血糖檢測(cè),并且可連續(xù)測(cè)定1 000次血糖樣品,低溫存放180 d仍可保持90%的酶活力。

　　食品中的農(nóng)藥殘留分析越來(lái)越受到人們的關(guān)注,蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)已成為目前人們研究的熱點(diǎn)。應(yīng)用有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶特異性抑制的酶化學(xué)比色分析法已被廣泛應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥的定性、定量檢測(cè)。于基成等[24]將植物酯酶共價(jià)結(jié)合到微孔塑料板上,制成農(nóng)藥快速檢測(cè)板,用于檢測(cè)有機(jī)磷類農(nóng)藥。建立的方法方便、快捷、檢測(cè)樣本容量大,結(jié)果能滿足蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。張淑平等[25]利用固定化的乙酰膽堿酯酶(AChE)制作一種可用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的快捷靈敏的傳感器,并探討了AChE 的固定化技術(shù)。固定化酶?jìng)鞲衅骶哂休^高的靈敏度和穩(wěn)定性,該檢測(cè)方法可以滿足對(duì)甲萘威農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)要求。

　　4固定化技術(shù)在食品工業(yè)中應(yīng)用的前景和發(fā)展

　　固定化技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用還很多,如固定化氨基�；�酶生產(chǎn)L-谷氨酸;固定淀粉酶和葡萄糖淀粉酶以淀粉為原料生產(chǎn)葡萄糖;固定化酶法釀造調(diào)味品等,但用于食品工業(yè)的酶遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于固定化酶。還有很多固定化酶和固定化細(xì)胞處于中試階段,固定化原生質(zhì)克服了固定化細(xì)胞的一些缺陷,但固定原生質(zhì)體還處于研究之中,未用于生產(chǎn)。人們清楚地看到了固定化技術(shù)的一些優(yōu)點(diǎn),雖然很多還處于研究和開(kāi)發(fā)中,但已經(jīng)給人們指明發(fā)展方向。隨著固定化技術(shù)的發(fā)展,將會(huì)有更多的固定化酶、細(xì)胞、原生質(zhì)體應(yīng)用于生產(chǎn)中,充分顯示出固定化技術(shù)的優(yōu)越性,開(kāi)啟固定化技術(shù)的新局面。

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