目前已證實(shí)I型糖尿病和自身免疫耐受缺失有關(guān)，自身反應(yīng)性T細(xì)胞在I型糖尿病的免疫發(fā)病機(jī)理中起主導(dǎo)作用[1]。移植胰島細(xì)胞治療I型糖尿病是一個(gè)具有前景的治療策略，然而自身反應(yīng)性T細(xì)胞的存在是胰島移植治療I型糖尿病方法中最大的障礙。

　　【摘 要】目前已證實(shí)I型糖尿病和自身免疫耐受缺失有關(guān)，自身反應(yīng)性T細(xì)胞在I型糖尿病的免疫發(fā)病機(jī)理中起主導(dǎo)作用。PD-L1已被證實(shí)為免疫負(fù)性調(diào)節(jié)受體 PD-1的配體，文獻(xiàn)證明PD-L1在免疫負(fù)性調(diào)節(jié)及外周耐受中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)在前期構(gòu)建PD-L1表達(dá)載體和初步研究其功能的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究 PD-L1對(duì)同種淋巴細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，通過(guò)建立穩(wěn)定表達(dá)PD-L1胰島細(xì)胞株，觀察PD-L1對(duì)同種淋巴細(xì)胞增殖的影響。

　　【關(guān)鍵詞】副主任中藥師職稱論文范文,I型糖尿病,PD-L1,NIT-1細(xì)胞

　　程序性死亡分子配體-1(PD-L1)和程序性死亡分子配體 -2(PD-L2)已被證實(shí)為PD-1的配體[2]。由于PD-L1在非淋巴組織的表達(dá)提示PD-L1可以調(diào)節(jié)自身反應(yīng)性T細(xì)胞或B細(xì)胞，同時(shí)(或者)調(diào)節(jié)靶器官的炎癥反應(yīng)。有研究表明，PD-L1信號(hào)可以介導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡，在腫瘤細(xì)胞逃逸免疫系統(tǒng)攻擊中起重要的作用。通過(guò)抗體阻斷PD-1：PD-L1這條通路可促進(jìn)NOD鼠糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[3]。本實(shí)驗(yàn)在前期構(gòu)建PD-L1表達(dá)載體和初步研究其功能的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究PD-L1對(duì)同種淋巴細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，通過(guò)建立穩(wěn)定表達(dá)PD-L1胰島細(xì)胞株，觀察PD-L1對(duì)同種淋巴細(xì)胞增殖的影響，為PD-L1修飾胰島細(xì)胞移植重建糖尿病患者胰島細(xì)胞功能研究提供新的策略。

　　1 材料

　　NIT-1細(xì)胞株(小鼠胰島β細(xì)胞株)由澳大利亞WEH1實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，本室傳代培養(yǎng)與保種。 pEGFP-N1-PD-L1 質(zhì)粒含有表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)基因序列，由本科室構(gòu)建。陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司，抗體、 CFSE購(gòu)于美國(guó)BD公司。

　　2 實(shí)驗(yàn)方法

　　2.1 轉(zhuǎn)染PD-L1基因的NIT-1細(xì)胞穩(wěn)定子篩選

　　根據(jù) Lipofectamine2000TM試劑說(shuō)明書進(jìn)行。將NIT-1細(xì)胞轉(zhuǎn)種于24孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞達(dá)到 50～80%的融合;用無(wú)血清培養(yǎng)基分別溶解pEGFP-N1/pEGFP-N1-PD-L1和脂質(zhì)體，將脂質(zhì)體與核苷酸混合，室溫下靜置30min后，在24孔板中加入以上混合液，輕混;培養(yǎng)6h后棄轉(zhuǎn)染液，加入完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)GRP78的表達(dá)。

　　2.2 CFSE染色檢測(cè)PD-L1修飾NIT細(xì)胞對(duì)同種淋巴細(xì)胞增殖影響

　　將Balb/c小鼠頸椎脫位處死，無(wú)菌取脾臟制備成脾淋巴細(xì)胞懸液，加入CFSE( 2μmol/L)染色 ，調(diào)整細(xì)胞濃度作為同種反應(yīng)淋巴細(xì)胞備用。用0.25%胰酶消化NIT、NIT-PD-L1和NIT-EGFP細(xì)胞，洗滌后用DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，加入無(wú)菌絲裂霉素C(終濃度為30μg/ml)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度作為刺激細(xì)胞備用。將Balb/c小鼠脾細(xì)胞懸液(反應(yīng)細(xì)胞)分別加入24孔培養(yǎng)板中，每孔5×106個(gè)細(xì)胞;將刺激細(xì)胞分別加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔5×105個(gè)細(xì)胞;實(shí)驗(yàn)分組：① NIT- PD-L1+淋巴細(xì)胞;②NIT-EGFP+淋巴細(xì)胞;③NIT+淋巴細(xì)胞。反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞懸液培養(yǎng)7天后FCM測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖。

　　2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

　　3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　3.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)NIT-1細(xì)胞中EGPF或PD-L1的表達(dá)

　　pEGFP-N1和pEGFP-N1-PD-L1表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染NIT-1細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，經(jīng)FCM檢測(cè)EGPF和PD-L1的表達(dá)。結(jié)果顯示：對(duì)照組(NIT)EGPF表達(dá)率為0，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染NIT細(xì)胞組EGPF表達(dá)率為87.2%±5.6，pEGFP-N1-PD-L1轉(zhuǎn)染NIT細(xì)胞組EGPF表達(dá)率為88%±6.8;對(duì)照組(NIT)PD-L1表達(dá)率為5.4%±0.8，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染NIT細(xì)胞組PD-L1表達(dá)率為 4.8%±1.5，pEGFP-N1-PD-L1轉(zhuǎn)染NIT細(xì)胞組PD-L1表達(dá)率為90%±5.3(P<0.01)。

　　3.2 PD-L1可顯著抑制同種淋巴細(xì)胞增殖

　　CFSE染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：NIT- PD-L1+淋巴細(xì)胞組增殖指數(shù)為(4.5±1.6);NIT-EGFP+淋巴細(xì)胞組增殖指數(shù)為(9.1±2.1);NIT+淋巴細(xì)胞組增殖指數(shù)為(8.5±3.1)。結(jié)果說(shuō)明PD-L1可以抑制同種淋巴細(xì)胞增殖，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

　　4 討論

　　PD- L1是正性或負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)的信號(hào)通路B7家族成員之一[4]。一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在非肥胖糖尿病(NOD)小鼠，體內(nèi)應(yīng)用拮抗的單克隆抗體(mAb)阻斷B7-H1可以活化效應(yīng)T細(xì)胞，結(jié)果促進(jìn)了自身免疫性糖尿病的發(fā)生發(fā)展，在半抗原誘導(dǎo)的小鼠接觸性過(guò)敏反應(yīng)模型或?qū)嶒?yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型中，B7-H1基因敲除同樣促進(jìn)了自身免疫性疾病的、發(fā)生發(fā)展[5-6]。以上結(jié)果說(shuō)明，PD-L1在同種免疫應(yīng)答中的重要負(fù)性調(diào)節(jié)功能。本實(shí)驗(yàn)以PD-L1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染NIT-1細(xì)胞作為體外細(xì)胞模型，研究PD-L1的負(fù)性調(diào)節(jié)功能。從細(xì)胞混合培養(yǎng)結(jié)果可以看出，PD-L1抑制淋巴細(xì)胞的增殖，提示PD-L1抑制反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的活化。本實(shí)驗(yàn)證明PD-L1對(duì)同種免疫應(yīng)答具有負(fù)性調(diào)節(jié)功能，并初步探討了其機(jī)制，對(duì)于誘導(dǎo)并維持免疫耐受具有一定作用。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1]Atkinson MA， Kaufman DL， Campbell L， et al. Response of peripheral-blood mononuclear cells to glutamate decarboxylase in insulin-dependent diabetes[J]. Lancet，1992：339，458. 　　[2]Freeman GJ， Long AJ， Iwai Y， et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation[J]. J. Exp. Med.， 2000：192，1027.

　　[3]Ansari MJ， Salama AD， Chitnis T， Smith RN， Yagita H， Akiba H， Yamazaki T， Azuma M， Iwai H， Khoury SJ， Auchincloss H Jr， Sayegh MH.The Programmed Death-1 (PD-1) Pathway Regulates Autoimmune Diabetes in Nonobese Diabetic (NOD) Mice[J]. J Exp Med.， 2003：63，69.

　　[4]Chen L. Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity[J]. Nat Rev Immunol， 2004，4：336-47.